Extracción del ADN en la broca del café

 

                                 

                                                                        

Se empleó el kit DyNAmo HS SYBR Green qPCR para amplificar secuencias del gen de la subunidad A del receptor GABA,  reportado en Hypothenemus hampei.

Las reacciones de PCR contenían 40ng de ADN plantilla, 0,3µM de cada primer y 1X del kit DyNAmo, en un volumen final de 10µL.

La amplificación consistió de un ciclo inicial  de 95°C por 11min., seguida por 35 ciclos  de 96°C por 10s, 50°C por 15s y 72°C  por 20s. Adicionalmente, se realizó una extensión a 72°C por 10min. y una curva de denaturación entre 75 y 85°C.

·         El porcentaje de muestras por tratamiento que amplificaron el fragmento P8 en reacciones de PCR.

·         El costo y el tiempo requerido en la extracción con cada uno de los tratamientos.

·         La presencia de bandas de alto peso molecular mediante la visualización del ADN en geles de agarosa al 1%.

·         La concentración de ADN, cuantificada por espectrofotometría.

·         Con el propósito de mejorar la amplificación y minimizar la presencia de impurezas en las muestras extraídas.

Las técnicas de extracción convencionales con el kit comercial de Qiagen (T1) y fenol cloroformo (T8), que incluyeron purificación de ácidos nucleicos, fueron las únicas técnicas que presentaron bandas de alto peso molecular, que indican ADN de alta calidad, mientras que con los otros métodos se observó la presencia de ADN degradado, excepto en el tratamiento 7, donde no se visualizó material genético.

Cabe anotar que en el 100% de las muestras se amplificó el fragmento P8, tanto a partir del ADN extraído con el kit de Qiagen (T1) como con los buffers TE (T3) y STE (T6). No obstante, la mejor calidad del amplificado se observó en las muestras extraídas con el kit comercial.

El ADN extraído con el buffer STE y posteriormente precipitado con etanol mostró una mejor calidad de los amplificados mediante PCR, e incluso permitió su uso en reacciones de PCR cuantitativo en tiempo real.

Cabe anotar que en el 100% de las muestras se amplificó el fragmento P8, tanto a partir del ADN extraído con el kit de Qiagen (T1) como con los buffers TE (T3) y STE (T6). No obstante, la mejor calidad del amplificado se observó en las muestras extraídas con el kit comercial.

El ADN extraído con buffer STE y almacenado a -20°C, se ha utilizado exitosamente en amplificaciones mediante PCR durante dos años sin observarse deterioro en la calidad.

Con el fin de evaluar la utilidad el método de extracción con el buffer STE en otros insectos, se extrajo el ADN de áfidos para amplificar regiones de ADN ribosomal con los primers ITS1 e ITS4 mediante PCR.

•   Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que existen métodos de extracción cruda que permiten la amplificación de fragmentos de ADN genómico de insectos mediante PCR, de manera rápida y sin incurrir en mayores costos.

·         La extracción de ADN de muestras biológicas es un paso crucial en los diagnósticos moleculares, ya que el éxito de los subsecuentes procesos depende de la cantidad y calidad de este.

·         Sin embargo, con los resultados obtenidos en este estudio, se demuestra que los métodos de extracción cruda permiten la amplificación de secuencias de ADN en reacciones de PCR.

·         La purificación previa del ADN para la obtención de copias de fragmentos de ADN mediante PCR.

Es una variante de la PCR, una técnica de laboratorio comúnmente usada en biología molecular para generar una gran cantidad de copias de ADN, proceso llamado amplificación (reacción en cadena de la polimerasa). En la RT-PCR, se retrotranscribe una hebra o cadena o banda de ARN en ADN complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa inversa o transcriptasa reversa, y el resultado se amplifica mediante una PCR tradicional. El término PCR en transcripción reversa no debe confundirse con la PCR en tiempo real, también denominada PCR cuantitativa (Q-PCR), que en ocasiones, por una mala traducción del inglés, se abrevia de la misma manera (RT-PCR, por Real Time-PCR), en vez de ReTi-PCR. La amplificación exponencial mediante PCR en transcripción reversa supone una técnica altamente sensible, que puede detectar un número de copias de ARN muy bajo.

Esta técnica es muy precisa, ya que se diseñan primers (también llamados cebadores) específicos para amplificar una secuencia determinada. 

Brinda un exhaustivo ensayo de predicciones para las secuencias franqueantes diseñadas y otras especificaciones que hacen de esta técnica la más utilizada hoy en día para identificar la existencia de la secuencia buscada.

Puede utilizarse como método de detección de molecular de genes, para estudiar el genoma de virus de ARN por ejemplo VIH,virus de influenza, Orthomyxoviridae o el SARS-CoV-2. 

La cuantificación de la expresión génica.

Prueba moleculares

Como la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) en tiempo real, es la prueba de referencia para detectar la presencia del virus SARS-CoV-2. Esta metodología consiste en la purificación del material genético (ARN) del virus a partir de la muestra y su posterior detección por medio de la RT-PCR. Este tipo de análisis generalmente se realiza en laboratorios de diagnóstico de alta complejidad equipados con infraestructura y equipamiento requerido para realizar técnicas de biología molecular. Si bien cuenta con una alta sensibilidad y especificidad, el procesamiento de muestras y en consecuencia la emisión del resultado puede tardar varias horas. La RT-PCR da positivo durante varias semanas después de la primera infección (30 días de media, según algunos estudios), ya que detecta la presencia del ARN del virus, aunque este ya no sea viable y el paciente haya superado la infección y ya no sea contagioso.​ Entre los test moleculares también se encuentra la amplificación mediada por transcripción (ATM). Los resultados pueden tardar menos de 3,5 horas.